|
|
Syntéza 5'-UTR varianty Var14 genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Petrovová, Gabriela ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cílem této práce bylo připravit syntetickou sekvenci 5'UTR sestřihové varianty Var 14 glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII). K tomu byla použita metoda dvoukrokové PCA. Sekvence byla rozdělena do 8 překrývajících se oligonukleotidů a spojena do jedné dsDNA pomocí dvou po sobě jdoucích PCR. Produkt syntézy byl zaklonován do pomocného vektoru pUC19. Po jeho osekvenování byly opraveny nalezené mutace. Produkt byl subklonován do cílového vektoru pcDNA4 His Var 14 již obsahujícího sekvenci vlastního genu GCPII. Tento konstrukt byl následně použit k sestrojení kalibrační křivky, která bude i nadále sloužit jako standard pro RT-PCR pro zjištění kvantity této varianty GCP II u pacientů s rakovinou prostaty. Konstrukt bude také používán jako expresní vektor pro produkci Var 14 varianty GCPII v eukaryontním baculovirovém expresním systému. Klíčová slova: 5'UTR, dvoukroková PCA, pUC19, RT-PCR, GCPII
|
|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Ulbrich, Pavel (oponent)
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
|
|
Mass Spectrometry-Based Identification of a Potential Binding Partner of Glutamate Carboxypetidase II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Český abstrakt Systémová biologie bude vyžadovat použití nových metod s vysokou propustností dat pro studium protein-proteinových interakcí. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii prošla v posledních letech rychlým vývojem a stala se nepostradatelným nástrojem studia makromolekul v základním i klinickém výzkumu. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII; EC 3.5.17.21) je transmembránový protein se dvěma známými enzymovými aktivitami. Tento enzym je exprimován ve větším množství v buňkách některých pevných nádorů a také obecně v neovaskulatuře pevných nádorů, nehraje zde však fyziologickou roli. Některé skutečnosti mohou poukazovat na potenciální receptorovou funkci GCPII, přirozený ligand tohoto proteinu však nebyl doposud identifikován. Pro hledání možných vazebných partnerů a/nebo ligandů GCPII byly použity metody afinitní chromatografie, imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie. Byla optimalizována metodika přípravy vzorků pro hmotnostní spektrometrii a analýza získaných dat s cílem nalézt možné vazebné partnery. Jeden z identifikovaných proteinů- β-podjednotka F1 ATP-syntasy, byl vybrán pro důkladnější analýzu možné interakce s GCPII.
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Preparation, expression and characterization of mouse GCPIII
Bäumlová, Adriana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent)
Slovenský abstrakt Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII, EC 3.4.17.21) je transmembránovým glykoproteínom II typu, ktorý bol objavený v nervovom systéme na základe degradácie N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamatu na N-acetyl-L-aspartát a L-glutamát, a preto sa predpokladá jeho účasť na nervovej signalizácií. Okrem mozgu, GCPII bola objavená vo väčšej miere taktiež v prostate, obličkách a tenkom čreve. V tenkom čreve GCPII napomáha vstrebávaniu folátov z potravy tým, že odštepuje koncové glutamáty z polyglutamylovaných folátov. V prostate nie je funkcia tohto proteínu doposiaľ známa, avšak využíva sa ako márker rakoviny. Mus musculus je dôležitým modelom pre štúdium GCPII a jej homológov ako terapeutického ciela. Ľudská GCPII a jej paralóg GCPIII sú pomerne dobre charakterizované, zatiaľ čo žiadna biochemická štúdia o ich myších ortológoch nie je dostupná. Preto sme myšaciu glutamátkarboxypeptidázu III (mGCPIII) naklonovali, pripravili rekombinantnou expresiou v hmyzích bunkách a chrakterizovali. Ukázali sme, že mGCPIII vykazujeα-glutamátkarboxypeptidázovú aktivitu, ktorá je inhibovatelná špecifickým inhibítorom GCPII, 2-PMPA. Taktiež sme testovali citlivosť a špecifitu monoklonálnych protilátok voči myšacej GCPIII. Imunochemická detekcia odhalila, že protilátka GCP-04 rozpoznáva ľudskú GCPII rovnako dobre ako...
|
|
|
Příprava a charakterisace rekombinantního dermcidinu jako potenciálního proteinového partnera glutamátkarboxypeptidasy II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proces novotvorby cévního zásobení je klíčový pro růst a přežití jakéhokoliv pevného nádoru. Zatímco většina nádorů zůstává nevaskularizována a zpravidla nepřesáhne svou velikostí několik milimetrů, některé novotvary prochází tzv. angiogenním přechodem, v důsledku čehož začne docházet tvorbě krevních tělísek. Počet buněk podstupujících apoptosu se snižuje a nádor se začíná rozrůstat. Je známo několik dobře prostudovaných faktorů, jež ovlivňují fyziologické děje spojené s novotvorbou cév. Tyto látky se mohou, ale nemusí vyskytovat i v tkáních nádoru. Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII; EC 3.4.17.21) je transmembránový glykoprotein II. typu, u něhož byly objeveny dvě fyziologicky významné enzymatické aktivity. GCPII je exprimována ve vaskulatuře pevných nádorů, přičemž zde však nebyla pozorována žádná funkce spojená s těmito aktivitami. Přestože se spekuluje o možné receptorové funkci GCPII, přirozený ligand dosud nebyl identifikován. Předcházející experimenty v naší laboratoři naznačily možnost interakce některých proteinů s GCPII. Jeden z nich- dermcidin byl vybrán jako možný vazebný partner, byl naklonován, exprimován v savčích buňkách a poté byla prověřena jeho možná interakce s GCPII pomocí nového detekčního systému využívajícího kotvu FLAG. Interakci in vitro se však nepodařilo potvrdit ani vyvrátit.
|
|
|
Fyziologická a patofyziologická role GCPII v organismu
Sedlák, František ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Klener, Pavel (oponent) ; Smetana, Karel (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je metaloproteáza zodpovědná za štěpení neurotransmiteru N-acetyl-aspartyl-glutamátu v centrálním nervovém systému na N-acetyl-aspartát a glutamát. Současně v lidském tenkém střevě napomáhá vstřebávání folátů pomocí odštěpování γ-vázaných glutamátů z folyl-poly-γ-glutamátu. GCPII je u člověka exprimována i v řadě dalších orgánů (např. ledviny a prostata) a nádorech, kde však její fyziologická funkce není známa. Při komplexním studiu role tohoto enzymu v savčím organismu jsme nejprve charakterizovali komerčně dostupné monoklonální protilátky proti GCPII. Dále jsme vyvinuli jejich plně syntetickou náhradu založenou na hydrofilním polymeru s navázanými GCPII inhibitory. Poté jsme zhodnotili vhodnost užití myšího biomodelu pro studium funkce GCPII in vivo, kdy jsme zachytili rozdíl v expresním profilu GCPII v myši a člověku. U myši ani v prostatě, ani v tenkém střevě jsme GCPII nepozorovali. Pro zhodnocení fyziologické a patofyziologické funkce enzymu jsme analyzovali myší GCPII-deficientní model. Kromě pozorování zvětšených semenných váčků u starších samců jsme nezjistili žádný další zjevný fenotyp. Obdobně jsme vyvrátili i schopnost GCPII štěpit amyloidní peptidy (Aβ1-40 a Aβ1-42). Ukazuje se tak, že chybějící aktivita GCPII v organismu nemá žádné evidentní...
|
|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Příprava rekombinantních protilátek s využitím metod proteinového inženýrství
Šulc, Josef ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Mikulecký, Pavel (oponent)
Tato práce popisuje tvorbu a vlastnosti disulfidicky stabilizovaného variabilního fragmentu protilátky 5D3 specificky rozpoznávající glutamátkarboxypeptidasu II, antigen úzce související s karcinomem prostaty i jinými nádorovými onemocněními. Malé protilátkové deriváty jsou v současnosti masivně využívány pro vývoj diagnostických a terapeutických nástrojů. Některé typy těchto derivátů však vykazují sníženou stabilitu terciární struktury, což může vést k nízkému výtěžku při produkci anebo ke zhoršení až ztrátě funkce proteinu. Tento problém je často řešen zaváděním strukturních změn pomocí proteinového inženýrství. Cílem práce bylo zavedení interdoménového disulfidického můstku do struktury jednořetězcového variabilního fragmentu protilátky za účelem zvýšení jeho stability. Vliv zavedené modifikace na stabilitu proteinu byl posuzován z hlediska výtěžku purifikovaného proteinu a jeho afinity k antigenu. Vyvíjený protilátkový derivát byl produkován v prokaryotickém expresním systému Escherichia coli s využitím signální sekvence směřující produkovaný derivát do periplasmatického prostoru. Snaha o stabilizaci proteinu probíhala pomocí mutageneze na pozicích G44 variabilní domény těžkého řetězce a G100 variabilní domény lehkého řetězce záměnou glycinů za cysteiny. Charakterizace purifikovaného proteinu proběhla s...
|
host ::
RSS.